為了保證分析檢測結(jié)果準確、可靠，必須對所采用的分析方法的準確性、科學性和可行性進行驗證，以證明分析方法符合檢測的目的和要求，這就是分析方法驗證。從本質(zhì)上講，方法驗證就是根據(jù)檢測項目的要求，預先設置一定的驗證內(nèi)容，并通過設計合理的試驗來驗證所采用的分析方法符合檢測項目的要求。方法驗證在質(zhì)量控制上有重要的作用和意義，只有經(jīng)過驗證的分析方法才能用于藥品生產(chǎn)的分析檢測，方法驗證是制訂質(zhì)量標準的基礎。方法驗證內(nèi)容包括方法的專屬性、線性、范圍、準確度、精密度、檢出限、定量限、耐用性和系統(tǒng)適用性等，檢測目的不同驗證要求也不盡相同。
1.專屬性
專屬性是指分析方法能夠?qū)a(chǎn)品和雜質(zhì)分開的特性，也稱為選擇性。對于純度檢測，可在標準品中加入產(chǎn)品中的已知雜質(zhì)，或者直接用粗品，考察產(chǎn)品峰是否受到雜質(zhì)的干擾，對于過程跟蹤，可用反應體系樣品來考察有沒有其它的雜質(zhì)干擾。必要時使用二極管陣列檢測器或者質(zhì)譜檢測器進行色譜峰純度檢查。一般要求產(chǎn)品和雜質(zhì)之間的分離度大于2.0。
2.線性
線性是在設定的范圍內(nèi)，檢測結(jié)果與樣品中原料或產(chǎn)品的濃度呈線性關系的程度。線性是定量檢測的基礎，需要定量檢測的項目都需要驗證線性。一般用貯備液經(jīng)過精密稀釋，或分別精密稱樣，制備得到一系列被測物質(zhì)的濃度（5個以上），按濃度從小到大運行序列，以峰面積和濃度的函數(shù)作圖，用zui小二乘法進行線性回歸計算，考察分析方法的線性。
3.范圍
范圍指在能夠達到一定的準確度、精密度和線性時，樣品中被分析物的濃度區(qū)間。簡單的說，范圍就是分析方法適用的樣品中待測物的濃度zui大值和zui小值。需要定量檢測的分析方法都需要對范圍進行驗證，純度檢測時，范圍應為測試濃度的80％～120％。
4.準確度
準確度是指測定的結(jié)果與真實值之間接近的程度，所以也叫做真實度，需要定量得分析方法均需要驗證準確度。準確度應在規(guī)定的范圍內(nèi)建立，對于原料藥可用已知純度的標準品或符合要求的原料藥進行測定，必要時可與另一個已建立準確度的方法比較結(jié)果。
5.精密度
精密度是指在規(guī)定條件下，同一均勻樣品經(jīng)多次取樣進行一系列檢測所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用相對標準偏差表示，取樣檢測次數(shù)應至少6次。
精密度可以從三個層次考察：重復性、中間精密度、重現(xiàn)性。
a、重復性是在相同的操作條件下、較短時間間隔內(nèi)，由同一分析人員測定所得結(jié)果的精密度。一般是用100％濃度水平的樣品測定6次的結(jié)果進行評價。
b、中間精密度：同一實驗室，在日期、分析人員、儀器等內(nèi)部條件改變時，測定結(jié)果的精密度。
c、重現(xiàn)性：指不同實驗室之間不同分析人員測定結(jié)果的精密度。
6.檢出限
檢出限是指樣品中的被分析物能夠被檢測到的zui低量，不需要準確定量。檢出限體現(xiàn)了分析方法的靈敏度。檢出限的測定可以通過對一系列已知濃度被測物的試樣進行檢測，以能準確、可靠檢出被測物的zui小濃度來確定，也可把已知濃度樣品的信號與噪聲信號進行比較，以信噪比為3：1時的濃度確定檢出限，一般要求能夠達到進樣濃度的0.05%。
7.定量限
定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量檢測的zui低量，其測定結(jié)果需要一定的準確度和精密度，定量限體現(xiàn)了分析方法靈敏定量檢測的能力。檢測需要嚴格控制含量的雜質(zhì)，必須考察方法的定量限，以保證雜質(zhì)能夠被準確定量。一般以信噪比為10：1時相應的濃度或進樣量來確定定量限。
8.耐用性
耐用性是指測定條件發(fā)生小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，耐用性主要表明方法的抗干擾能力，主要的變動因素包括：流動相的組成、流速和pH值、色譜柱、柱溫等。經(jīng)試驗，應說明小的變動能否符合系統(tǒng)適用性試驗要求，以確保方法有效。
9.系統(tǒng)適用性試驗
液相色譜分析方法主要依賴液相色譜儀和色譜柱，在做方法驗證時，有必要將液相色譜儀、色譜柱、流動相與實驗操作、待測樣品等一起當作完整的系統(tǒng)進行評估，并將系統(tǒng)適用性作為分析方法的組成部分，系統(tǒng)適用性便是對整個系統(tǒng)進行評估的指標。一般系統(tǒng)適應性的要求為：分析方法能夠達到0.05%的檢出限，主峰的拖尾因子0.5<Tf<2.5，主峰與雜質(zhì)的分離度大于2.0，空白干凈，主峰處無系統(tǒng)峰干擾。
分析方法開發(fā)與驗證是一個整體，在實際工作中，一般是先開發(fā)分析方法，經(jīng)過適當?shù)膬?yōu)化以后再做方法驗證，驗證的部分內(nèi)容在分析方法開發(fā)時就要做，比如說分析方法的專屬性驗證。分析方法驗證并非必須驗證所有的內(nèi)容，只要注意驗證內(nèi)容充分，足以證明分析方法的合理性就可以了，如雜質(zhì)限度檢測一般只需要驗證專屬性和檢出限，而精密度、線性、定量限等涉及定量測定的項目，則不需要驗證。
有時需要對分析方法進行全面或部分的再驗證。當原料藥合成工藝發(fā)生改變時，可能引入新的雜質(zhì)，雜質(zhì)檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要再進行驗證，以證明有關物質(zhì)檢查方法能夠檢測新引入的雜質(zhì)，且新引入的雜質(zhì)對主成份的含量測定應無干擾。當分析方法發(fā)生部分改變時，如檢測波長發(fā)生改變，則需要重新進行檢測限、專屬性、準確度、精密度、線性等內(nèi)容的驗證，以證明改變后的分析方法的合理性、可行性。
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